摘要：目的：研究殼聚糖絮凝劑對(duì)于產(chǎn)水提部位黃芪甲苷和多糖的影響。方法：經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定澄清劑，以黃芪甲苷、多糖為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)殼聚糖絮凝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：殼聚糖加入量5%，藥液相對(duì)密度1.07 g·ml-1，藥液pH值4.5時(shí)絮凝。結(jié)論：殼聚糖絮凝法澄清效果好，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可用于水提部位的澄清。
關(guān)鍵詞：產(chǎn)婦康；殼聚糖；黃芪甲苷；粗多糖；高效液相色譜
產(chǎn)主要由黃芪、益母草、當(dāng)歸、川芎等藥材組成，主要用于產(chǎn)后康復(fù)，治療產(chǎn)后婦女惡漏不盡，補(bǔ)氣養(yǎng)血，活血祛淤，促進(jìn)子宮收縮，利于產(chǎn)后恢復(fù)。工藝中水提部位所含的黃芪甲苷和多糖具有明顯的生理活性，如果采用傳統(tǒng)的醇沉除雜，會(huì)降低多糖等有效成分的含量，且醇沉法耗醇量大，成本高〔1〕。我們采用殼聚糖絮凝沉降法對(duì)水提液進(jìn)行澄清，并選出除雜工藝〔2〕。
1實(shí)驗(yàn)器材
高效液相色譜儀（島津10AT-VP），HW-2000色譜工作站，SEDEX75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，超聲清洗器〔33KHZ±2HZ，(250±70)W，上海船舶電子設(shè)備研究所〕。黃芪甲苷對(duì)照品（供定量用）由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純，供試樣品由湖北省中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心提供。
2方法與結(jié)果
2.1黃芪甲苷含量測(cè)定方法〔3〕
2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Eclipse XDB-C18（4.6 mm×25 cm）色譜柱，甲醇水（80∶20）為流動(dòng)相，流速1 ml·min-1，ELSD漂移管溫度35℃，載氣（N2）流速 3.5bar。
2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密烘箱稱取黃芪甲苷對(duì)照品加甲醇溶解，使成0.168 mg·ml-1的溶液。
2.1.3供試品溶液的制備精密烘箱稱取相當(dāng)于1 g黃芪的稠膏，加入2%氫氧化鉀甲醇50 ml，超聲提取30 min，放冷濾過(guò)，移取續(xù)濾液25 ml，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，水層用氯仿正丁醇（2∶1）振搖提取5次，10 ml/次。合并氯仿正丁醇（2∶1）提取液，用氨試液提取2次，25 ml/次。棄去氨試液，取氯仿正丁醇（2∶1）液置水浴上蒸干，殘?jiān)勇确聼o(wú)水乙醇（3∶1）5 ml分次轉(zhuǎn)溶到硅膠柱（內(nèi)徑1 cm，長(zhǎng)10 cm，干法裝柱）上，以氯仿無(wú)水乙醇（3∶1）洗脫至洗脫液近無(wú)色（約15 ml），棄去洗脫液，續(xù)用無(wú)水乙醇40 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
2.1.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取黃芪甲苷對(duì)照品加甲醇溶解，使成0.168 mg·ml-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取2，4，6，8，10，12 μl注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量和峰面積的對(duì)數(shù)進(jìn)行回歸計(jì)算，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為lgA=1.629 lgM 5.266 1，r=0.999 4。結(jié)果表明在0.336～2.016 μg范圍內(nèi)，黃芪甲苷峰面積值的對(duì)數(shù)A與進(jìn)樣量M的對(duì)數(shù)有良好的線性關(guān)系。
2.1.5度實(shí)驗(yàn)吸取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5次，6 μl/次，峰面積平均值為200 612，RSD為1.4%。
2.1.6重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品，制備五份供試品溶液，進(jìn)樣。樣品含量平均值為0.120 2 mg·g-1，RSD為1.5%。
2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品供試液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣，峰面積平均值為174 691，RSD為1.4%，說(shuō)明黃芪甲苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.8加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的樣品約4.0 g，共6份，稱定，分別加入不同量的對(duì)照品溶液，揮干甲醇，照供試品溶液制備供試樣，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率為97.13%，RSD為1.4%。
2.1.9樣品的測(cè)定分別吸取對(duì)照品溶液4 μl與8 μl，供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，取峰面積的對(duì)數(shù)，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，即得。見(jiàn)圖1。
圖1黃芪甲苷測(cè)定HPLC-ELSD色譜圖（略）
2.2粗多糖的含量測(cè)定精稱樣品1.0 g稠膏，置100 ml燒杯中，加入蒸餾水50 ml，攪拌30 min，靜置，濾過(guò)。精取續(xù)濾液20 ml，置100 ml錐形瓶中，加入Ca（OH）2溶液40 ml，水浴加熱30 min，待沉淀，拿出放冷，離心。棄去上清液，殘?jiān)铀?0 ml洗滌，離心，棄去洗滌液，殘?jiān)铀? ml攪勻，滴加草酸銨試液，邊加邊攪拌，至沉淀不再生成，離心，上清液置已恒重的蒸發(fā)皿中，殘?jiān)铀? ml洗滌1次，洗滌液并入蒸發(fā)皿中揮干，置烘箱中，于105℃干燥5 h，稱重，計(jì)算粗多糖的含量。
2.3澄清劑的優(yōu)選
2.3.1殼聚糖溶液的配制稱取殼聚糖1 g加1%醋酸溶液制成1%的殼聚糖溶液。
2.3.2供試液的制備按處方稱取藥材總量425 g，照優(yōu)選的提取工藝煎煮，過(guò)濾，同法制備9份，分別照正交表實(shí)驗(yàn)條件安排實(shí)驗(yàn)，離心,將濾液濃縮成稠膏，照上述方法測(cè)定黃芪甲苷和多糖的總量。
2.3.3殼聚糖澄清工藝正交實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖加入量，藥液pH值，相對(duì)沉降密度三個(gè)因素為考察對(duì)象，選用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，對(duì)澄清工藝進(jìn)行考察，因素水平見(jiàn)表1。
表1澄清工藝的因素與水平（略）
根據(jù)因素水平表，我們選擇了L9（34）正交表，照上述供試液制備方法制備樣品，測(cè)定其黃芪甲苷和多糖總含量為檢測(cè)指標(biāo)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。
表2澄清工藝的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（略）
由上表的直觀分析可以看出影響黃芪和多糖量的實(shí)驗(yàn)因素都為A＞C＞B。為了進(jìn)一步估計(jì)實(shí)驗(yàn)中所存在的誤差大小,我們作了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析。結(jié)果見(jiàn)表3～4。
由方差分析可知，以黃芪甲苷為考察指標(biāo)，各因素作用主次為A＞C＞B，A、C有顯著性影響，以A1B2C2為；以多糖為指標(biāo)，各因素作用主次為A＞C＞B，A、C有顯著性影響，以A1B2C1為工藝。綜合考慮，由于黃芪為方中主要的藥味，且黃芪甲苷為主要的有效成分，因此將黃芪甲苷作為主要考察指標(biāo)，優(yōu)選A1B2C2為條件，即5%的殼聚糖，藥液pH值為4.5，密度為1.07 g·ml-1時(shí)加入。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取同樣處方量，按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最加工藝條件，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得多糖和黃芪甲苷含量數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。
表3水提液中黃芪甲苷的方差分析（略）
表4多糖總量的方差分析（略）
表5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg實(shí)驗(yàn)（略）
3討論
3.1殼聚糖沉降法能較大程度的保留產(chǎn)婦康水提液中黃芪甲苷和多糖等有效成分的含量，且用量少，成本低。
3.2殼聚糖是含氨基基團(tuán)的高分子長(zhǎng)鏈化合物。在酸性條件下，可很好的伸展其長(zhǎng)鏈，成為陽(yáng)離子型絮凝劑，同時(shí)發(fā)揮吸附架橋和電中和作用，以達(dá)到澄清的目的。本藥液pH值為4.5，符合沉降條件。藥液濃縮密度和殼聚糖用量大對(duì)黃芪甲苷和多糖量的都有影響。
3.3實(shí)驗(yàn)證明，含有黃芪甲苷的樣品經(jīng)硅膠柱處理后，能消除雜質(zhì)峰的干擾，基線非常平穩(wěn)，且回收率較好。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的含量，分離度好，靈敏度較高，重現(xiàn)性好.