2023年10月華中科技大學同濟醫學院同濟醫院神經內科汪明煥團隊于Nature子刊Translational Psychiatry在線發表了一篇題為“Melatonin alleviates depression-like behaviors and cognitive dysfunction in mice by regulating the circadian rhythm of AQP4 polarization”的文章，驗證了褪黑素通過調節水通道蛋白4（AQP4）的晝夜節律減輕小鼠抑郁行為和認知功能障礙的機制。在實驗過程中，實驗者發現由于星形膠質細胞中AQP4晝夜節律調節紊亂，導致了慢性不可預測輕度應激（CUMS）小鼠在睡眠-覺醒周期中的glymphatic通路破壞，表現為CUMS小鼠白天睡眠碎片化，總睡眠時間和非快速眼動睡眠（NREM）時間減少。
在評估褪黑素通過調節AQP4晝夜節律影響小鼠睡眠質量的過程中，實驗者在小鼠顱骨上植入腦電信號采集電極，并在頸部肌肉處植入肌電電極，通過頭戴式裝置連接到數據采集器以長時間記錄小鼠的腦電（EEG）和肌電（EMG）信號，以此分析褪黑素對CUMS小鼠睡眠結構的影響。（圖A）
在白天，CUMS組的總睡眠時間和非快速眼動睡眠（NREM）的持續時間減少，但褪黑素治療組小鼠則恢復正常。在夜間，對照組、CUMS和褪黑素治療組三組小鼠的總睡眠時間、快速眼動睡眠（NREM）和快速眼動睡眠（REM）持續時間沒有差異，24小時的總睡眠時長也沒有差異（圖B-E）。這些結果表明，褪黑素治療可恢復CUMS小鼠的睡眠節律，尤其對白天效果更為顯著。
在評估小鼠睡眠質量方面，作者則是通過對小鼠睡眠潛伏期、睡眠持續時間和睡眠-清醒時相轉變次數進行評估（圖F）。與對照組相比，CUMS組的睡眠潛伏期增加，褪黑素治療顯著縮短了睡眠潛伏期（圖G）。對24小時和白天記錄的分析顯示，CUMS組的睡眠時間縮短，并通過服用褪黑素而增強（圖H）。夜間小鼠在睡眠持續時間和睡眠-清醒時相轉換次數上在三組之間沒有顯著差異。上述結果表明，褪黑素通過增加睡眠節段持續時間而不增加睡眠節段次數的方式提高了CUMS小鼠的睡眠質量。
腦電肌電（EEG/EMG）睡眠分析的“前世今生”
汪明煥團隊采用的腦電肌電采集系統研究睡眠的方法可追溯至19世紀，1929年，Hans Berger等學者便發現，從人類頭皮上記錄的腦電信號呈正弦波，其頻率與受試者的清醒程度直接相關，這直接導致了神經科學研究者對包括人類和動物的睡眠-覺醒調節相關的神經電生理研究的進步。
隨著科學技術的發展，人們對睡眠相關的神經電生理的研究也在不斷產生巨大飛躍。2016年Yo Oishi等在“Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice”論文中詳細闡述了嚙齒動物的睡眠特征，即睡眠包括快速眼動（REM）和非快速眼動（NREM）兩種模式。快速眼動睡眠的特點是腦電圖呈現快速的低電壓波形，主要由5.5-8.5 Hz的θ波段為主，伴隨有隨機的眼球運動和肌肉松弛；非快速眼動睡眠的特點則是腦電圖呈現慢速的高電壓波形，主要由0.5-4 Hz的δ波段為主，不伴有眼球的運動。
時至今日，腦電圖（EEG）與（EMG）的記錄已經是睡眠相關動物實驗和臨床評估必部分，該類研究可將實驗對象的行為、生理學與大腦皮層神經元的活動相關聯。
嚙齒動物腦電肌電采集與分析的“選手”
美國Pinnacle公司生產的一站式EEG/EMG采集系統是在上述理論基礎上應運而生的大小鼠睡眠研究解決方案，該系統被國內外大量腦科學研究者應用于不同的睡眠模型當中，引用文獻達上千篇，得到了充分的科研實驗驗證。Pinnacle EEG/EMG采集系統包括有線式和無線式兩種類型，并配有專業的高級睡眠分析軟件Sleep Pro，用于數據采集后的睡眠離線分析。
1.硬件系統
美國Pinnacle有線式EEG/EMG系統采用低扭矩萬向轉向設計規避動物活動對數據采集線纜產生扭轉、纏繞等現象，保證動物信號采集過程活動不受影響。獨特的頭戴式前置放大器設計將腦電信號進行放大和過濾，旨在降低信號偽影（包括運動偽影），再加上數據采集器進行二次數據放大和過濾，從而可獲得異常干凈的數據波形。
2.植入耗材
在腦電和肌電植入操作上，Pinnacle建議將分別植入顱骨前囟點前后2-3mm的位置，在此位置可記錄到較為明顯的動物前額葉皮層的腦電信號，而在肌電植入時，根據動物睡眠與清醒頸背肌肉放電存在顯著差異，實驗中肌電電極均會在頸部肌肉處植入。按上述方法在動物頭部安裝采集腦電肌電的頭戴式頭帽，方便后續連接信號采集器采集數據。Pinnacle除了提供大小鼠腦電肌電采集硬件系統，還提供全套腦電肌電植入耗材以及操作器械，方便用戶快速上手操作，加快實驗進度。
3.專業版睡眠分析軟件
Pinnacle還配套專業版睡眠分析軟件Sirenia Sleep Pro，通過動物腦電δ波、θ波以及肌電信號的強弱，基于多種評分工具，對動物各睡眠時相進行快速準確的評分分析，獲得動物睡眠覺醒時相圖、睡眠時長、覺醒次數等睡眠相關數據。經Sleep Pro軟件分析獲得的數據準確性達90%以上，15min內即可對動物24h腦電數據進行完整分析，是目前國際上高效和準確的睡眠分析軟件之一。
Sirenia Sleep Pro具有自動化的睡眠統計分析功能，可對動物睡眠的不同時相進行時間統計，包括清醒、REM和NREM的時間、數量和百分比統計，用于分析動物的不同睡眠節段的時長；睡眠節段包括動物不同睡眠時相的切換次數和切換時間間隔可評估動物的睡眠質量。用戶可一鍵生成統計圖或自定義生成圖表，多種數據呈現方式有利于文獻的發表。
除了有線式EEG/EMG采集系統，Pinnacle還推出了一款無線式EEG/EMG系統，該系統利用輕巧的無線穩壓器裝置在動物頭部即完成腦電肌電信號等數字化處理，并通過藍牙傳輸至電腦采集軟件進行處理分析。無線式EEG/EMG系統消除了傳統有線式設備對于動物活動的限制，使動物更加接近于其生理狀態，特別適合與迷宮、探洞等行為學實驗聯合使用。
上海玉研科學儀器有限公司與美國Pinnacle公司保持長期友好合作關系，我們致力于研發和引進的科學儀器，為國內外實驗室建設、課題研究推薦科學合理的解決方案，并提供最真誠可靠的技術服務。
更多案例
案例1
2017年霍普金斯大學醫學院神經科學系Kai Liu等研究者在Nature上發表了題為“Lhx6-positive GABA-releasing neurons of the zona incerta promote sleep”的高分文章，實驗者采用Pinnacle EEG/EMG采集系統驗證了下丘腦腹側核帶GABA能神經元釋放的Lhx6因子對睡眠有促進作用。
實驗中，研究者使用Pinnacle 4通道有線式2EEG/1EMG/1BIO系統，通過在小鼠頭骨上錨定螺釘電極（用于記錄EEG1信號的兩個前螺釘的位置分別為：AP:+2 mm，ML:±1.5 mm。用于記錄EEG2信號的兩只后螺釘的位置為：AP:?4 mm，ML：±1.5 mm），并將兩個EMG電極插入小鼠左右頸部肌肉，然后用牙科水泥固定頭帽和電極。待動物恢復10天左右將動物放入12h-12h晝夜節律的記錄室中，動物在其中適應5-7天后使用 Pinnacle Sirenia acquisition基礎軟件記錄小鼠的腦電肌電信號。
Pinnacle EEG/EMG系統采集的實驗組和對照組的小鼠腦電圖，圖中顯示了清醒階段（黃色），快速眼動睡眠階段（紅色）和非快速眼動睡眠階段（紫色），以及實時睡眠圖、FFT生成的δ功率圖、EEG頻譜圖以及EEG/EMG原始圖。
案例2
2022年哈佛醫學院精神病學系David S. Uygun等在Nature上發表了題為“Knockdown of GABAA alpha3 subunits on thalamic reticular neurons enhances deep sleep in mice”的高分文章，探究丘腦網狀神經元GABAAα3亞基對深度睡眠的影響。實驗中為了記錄小鼠皮層腦電，研究者采用Pinnacle 2EEG/EMG系統，將EEG螺旋電極分別植入AP+1.9 mm，ML±1.5點，參考電極植入AP?3 mm，ML+2.7，接地電極植入AP?6 mm， M L=0處，并將電極焊接在頭帽上，然后將EMG電極植入到小鼠頸部肌肉中，最后用牙科水泥固定頭帽和電極。動物恢復一周后分別在注射AAV前后記錄小鼠的EEG/EMG信號，并用Sleep pro離線睡眠分析軟件進行了睡眠階段分析。
與對照組相比，α3KD小鼠和α1KD小鼠實驗組小鼠的NREM持續時間和次數沒有顯著改變；在α3KD小鼠中，持續<60 s的時間節段比例顯著減少，而α1KD小鼠組小鼠與對照組之間沒有顯著差異。
擴展閱讀
[1].Yao, D., et al., Melatonin alleviates depression-like behaviors and cognitive dysfunction in mice by regulating the circadian rhythm of AQP4 polarization. Translational Psychiatry, 2023. 13(1): p. 310.
[2].Uygun, D.S., et al., Knockdown of GABAA alpha3 subunits on thalamic reticular neurons enhances deep sleep in mice. Nature communications, 2022. 13(1): p. 2246.
[3].Liu, H., et al., Microglia modulate stable wakefulness via the thalamic reticular nucleus in mice. Nature Communications, 2021. 12(1): p. 4646.
[4].Wang, D., et al., GABAergic Neurons in the Dorsal–Intermediate Lateral Septum Regulate Sleep–Wakefulness and Anesthesia in Mice. Anesthesiology, 2021. 135(3): p. 463-481.
[5].Xing, L., et al., Mutant neuropeptide S receptor reduces sleep duration with preserved memory consolidation. Science translational medicine, 2019. 11(514): p. eaax2014.
[6].Jiang-Xie, L., et al., A common neuroendocrine substrate for diverse general anesthetics and sleep. Neuron, 2019. 102(5): p. 1053-1065. e4.
[7].Liu, K., et al., Lhx6-positive GABA-releasing neurons of the zona incerta promote sleep. Nature, 2017. 548(7669): p. 582-587.
[8].Ehlen, J.C., et al., Bmal1 function in skeletal muscle regulates sleep. Elife, 2017. 6: p. e26557.
[9].Anaclet, C., et al., Basal forebrain control of wakefulness and cortical rhythms. Nature communications, 2015. 6(1): p. 8744.
[10].Anaclet, C., et al., The GABAergic parafacial zone is a medullary slow wave sleep–promoting center. Nature neuroscience, 2014. 17(9): p. 1217-1224.
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